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                  ELISA相关问题与解答

                  浏览次数:日期:2014-10-15

                  摘要:

                  1、ELISA检测所用的样本怎样进行采取和保存?

                  解释:大部分ELISA 检测均以血清或血浆为样本。血清样本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP 为标记的ELISA 测定中,溶血样本可能会增加非特异性显色。血清样本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。一般说来,在5 天内测定的血清样本可放置于28℃,样本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合,特别是使得间接法试剂的本底加深;超过一周测定的样本需-20℃或以下保存,冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清样本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清样本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。抗凝不完全的样本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性,建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。

                  2、ELISA检测时如何保证有效洗涤?

                  解释:洗涤是将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来,以保证ELISA测定的特异性。因此,洗板对于ELISA测定来说,是极其关键的一环。

                  1)  强烈建议使用全自动洗板机洗涤,手工洗涤容易造成交叉污染;

                  2)  定期对洗板机进行维护保养,使用前检查有无堵孔现象,吸液、注液及走板等运行是否正常,一般要求,吸干后每孔的残留量不超过2ul,注液量每孔大于250ul,但不能漫溢,同时设置一定的浸泡时间,60/遍,至少洗涤5遍。

                  3、ELISA实验比色中单波长和双波长的区别?

                  解释:

                  1)中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能,所谓的单波长测量即选择对终止后显黄色的液体具有最大吸收的波长450nm进行比色测定,得到各孔的A值,其中此A值包括了本身液体颜色的吸收值(W1)和非特异吸收值(W2),非特异吸收值一般值板孔及孔底上指纹、刮痕、灰尘等脏物吸收值,则W1=A-W2,我们比色时设置空白调零,就是把其作为非特异吸收值进行相减,其实并不是每个孔的非特异吸附值都是一样的,故单波长测量有一定程度的不确定性,也就是说空白孔位置不同均有可能得到不同吸光度值,只是在可接受范围内。

                  2)而波长双色则酶标仪在敏感波长450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次,敏感波长的吸光度测定值为特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和(M1);非敏感波长下测定,此时特异显色的吸光度值为零,而测得的吸光度即为脏物的吸光度值(M2),最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差(A=M1-M2, 故而在测定比色时,最好是使用双波长比色。

                  3)选择双波长比色时不必设空白孔调零,若仍设空白孔调零比色,就有可能会出现吸光度为负数的现象。

                  4、ELISA检测试剂敏感度偏低的处理方法?

                  解释:    
                  1 重新实验,并在实验中注意试剂盒的温度平衡、温育的时间、显色的时间等影响因素的控制;
                  2 检查质控品是否有反复冻融的情况、质控品是否有批内差异、质控品是否为28℃久置;
                  4 重新评估质控品的可靠性;
                  5 样本本身由于各种因素影响而表现为弱阳性,实际上为阴性样本;
                  6 由于样本自身含量较低,易随实验水平波动。对这部分样本的处理应格外慎重,有条件的用户应进行确证实验;
                  7 注意检查实验中所用的仪器设备是否定期校准;
                  8 注意检查实验中所用的板、酶标试剂批号是否相同,不同批号试剂不得混用。

                  5ELISA产品检测时,出现本底偏高或者“花板”现象的主要原因分析?

                  解释:

                  洗涤原因:

                  1)各个厂家使用的洗涤液配方根据各自试剂的条件配制的,采用不配套的洗液常达不到正常的洗涤结果,主要会造成本底过高,甚至出现花板现象。本公司的洗涤系统不建议和其它公司的试剂盒混用。

                  2)配置洗液的水应该采用新鲜的蒸馏水或去离子水,倘若使用自来水,水中含有过多的Ca2+Mg2+,这些离子会占用表面活性剂,影响洗涤效果,同时水中一些微生物释放的内源性物质会造成干扰,出现过高的非特异性反应。

                  3)洗板时,应保证洗板机的每孔注液量和吸液残留量正常方可使用,否则影响洗涤效果,一般注液量要求在300350μl/孔,但不应溢出,避免交叉污染,吸液残留量≤2μl,至少洗涤5遍。

                  显色系统原因:

                  1)底物B液已微变色造成本底偏高。

                  2)反复使用的枪头、加样槽清洗不当,也会干扰,使得底物AB液发生非特异反应。

                  样本自身原因:

                  1)使用了溶血样本,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,会增加非特异性显色;血清样本比较陈旧,如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会增加非特异性显色。

                  2)使用了抗凝不完全的样本,因纤维蛋白原的干扰而造成非特异性显色,建议尽量不用抗凝血,尤其是肝素抗凝样本。

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